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定量PCR实验技术分享1

时间:2017-08-02 浏览次数:981

1.  如果扩增曲线ct值比较靠后的话,32左右,一般有 什么方法解决没有

 

ct值比较靠后,对实验有一定的影响,因为经 过那么多次的循环,酶的活 性有可能有所下降,这时候 扩增效率会有所改变(而定量PCR的理论 基础就是每次循环的扩增效率我们认为是确定的一个值)。因此zui好能够把ct值往前移。
 

解决办 法可以将模板加以浓缩或者抽干之后用少量水去溶解。

 

 

2. 为什么 合成的引物做不加摸板的对照也能扩增出目的条带,而内参 用同样体系就没有呢?

 

引物被污染。

 

3. 实时定量PCR,荧光定量PCR,实时荧光定量PCR,real-time PCR,这些是 不是同一个概念

 

是一个概念。

 

4. 我的标准曲线的slope总是大于4,而且每个梯度的平行ct值差别比较大,原因?

 

这个斜率是=1/LOG 10(扩增效率),理论上扩增效率=2,斜率是3.322。如果斜率大于4,说明扩增效率比较小。可以考 查一下反应体系是否合理?酶活是否正常?
 

平行管的CT值差别 大可以考查一下自己实验操作是否规范,另外一 种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

 

当斜率为4的时候,扩增效率是77.8%,斜率大于4的话,效率继续下降。
 

扩增效 率的问题实际就是引物的扩增效率,可能酶 活的关系没有那么重要,前提是 试剂盒的质量有保证。回到扩增效率,只有在 引物和模板处于zui适比例 时才能得到比较满意的扩增效率,因此通过调节PCR反应体 系中的引物终浓度来解决,可以做 一些引物梯度来比较。

 

5. ROX染料是什么作用?

 

ROX的作用ABI宣称是 用来校准加样误差的。
 

但是据说ROX的作用 实际上是用来校准光程差的。即每个 孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候,走过的 光程是不一样的,这样在CCD上成像 的亮度就不一样了。所以需 要把这个差异用ROX来计算 孔间差异有多大,然后差异系数去处理,实际的荧光信号。具体过 程我不是非常清楚,请高手指正。

 

 

6. 荧光定量PCR的基线,是怎么确定的呢?

 

基线就是背景值,因此就是曲线在没有“起跳”之前的一段。在软件 上有一个地方可以输入baseline从第几到第几cycle作为基线。设置原 则是使没有起跳之前zui多的cycle的信号接近0。

 

 

7. 我刚准备做定量,请教一下,不知道 伯乐的机子怎么样?请推荐几个合适的SYBR GREEN的盒子,1000以内的(没钱不好办啊),我大约做20个样。现在对SYBR GREEN认可吗?


伯乐的机子不错。takara的试剂盒,大概在1500元,400个反应。大部分人做还是用sybr green I的。这是zui常用的染料。