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体外细胞的原代培养、传代培养、冻存和复苏2

时间:2017-08-02 浏览次数:1354

一、实验原理

细胞培 养可分为原代培养和传代培养。直接从 体内获取的组织细胞进行培养为原代培养;当原代 培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养, 即将培 养的细胞分散后,从一个容器以1:2或其他 比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养,传代培 养的累积次数就是细胞的代数。

细胞冻 存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以zui大限度 的保存细胞活力。目前细 胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂,这两种物质能提高 细胞膜对水的通透性,加上缓 慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细 胞内冰晶的形成,从而减 少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细 胞应采用快速融化的方 法,这样可 以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由 于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

二、实验方法

材料:

小鼠,生理盐水,100ml灭菌烧杯,15ml离心管,培养皿,滴管,无菌镊子、剪刀,筛网,泡沫板,大头针,酒精灯,培养瓶,培养 液,PBS,0.25%胰酶,超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜,显微镜,计数板,离心机,恒温水浴箱,冰箱(4℃、-20℃、-70℃),液氮 罐,冻存管,冻存液,废液缸等。

方法:

(1)原代培养:

1.取出小鼠后沥干酒精,放入超净台内,固定在泡沫板上。

2.用镊子提起皮肤,用解剖 剪剪开皮肤一个横切口,将皮肤向上撕开,然后剪开肌肉等,暴露出腹腔,在左侧找到脾脏,用弯头 眼科镊取出脾脏,置于无菌培养皿中。

3.用生理 盐水将取出的脾脏清洗多次,并剔除 多余无用的组织。

4.将筛网置于平皿中,脾脏置于筛网上,用弯头镊镊住,轻轻在 筛网上进行碾磨,同时不 停滴加不含血清的培养液冲洗。

5.将碾磨 好的细胞悬液吸入至离心管中,离心(1000rpm,5min),吸去上清(去除血液等)。

6.加入10ml培养液,吹打混匀,取样计数。

7.将稀释 好的细胞悬液分装于培养瓶中,轻轻摇晃混匀,在培养瓶上。

面做好标志,注明细胞、组别及日期。然后将 培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。

(2)传代培养:

1.倒置显 微镜下观察细胞形态,确定细 胞是否需要传代。

2.培养液瓶打开后,过酒精灯火焰,置酒精灯火焰周围。

3.拿出直头滴管,套上橡皮吸头,过火,放入培养液瓶中。

4.打开培养瓶,瓶口过火,将培养 瓶内的培养液轻轻倒入废液缸,用2-3mLPBS洗去残留的旧培养基。

5.培养瓶加入0.25%胰酶,用量以 薄薄盖满一层为宜,37℃消化,倒置显 微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉,加入少 量的含血清的新鲜培养基。

6.取弯头 滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散,再根据 分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基,制成细胞悬液,然后分 装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。

7.对半贴壁培养细胞,不需胰酶,直接吹打,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。

(3)冻存:

1.吸取传 代后的细胞悬液,离心,去除培养液,加入冻存液,分装冻存管(冻存管 内细胞数目一般为(5~10)×106个/ml,2ml冻存管中一般放1~1.5ml细胞)。

2.按步冻存

o冷冻保存方法一:标准的 冻存程序为降温速率-1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至-5~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。

o冷冻保存方法二:冷冻管 置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1~3℃至-80℃以下,再放入液氮长期保存。

(4)复苏:

1.取出冷冻管,立即放入37℃水浴箱中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,移入无菌操作台内。

2.打开冻存管,将细胞 悬液吸到离心管中。

3.1000rpm离心10分钟,弃去上清液。

4.加适当 培养液后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,第二天观察生长情况。