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体外细胞的原代培养、冻存和复苏,传代培养

时间:2017-08-02 浏览次数:1135

三、实验结果计算

1.一只小鼠可获得(1~2.5)×108个脾细胞。

2.细胞接 种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长,如接种 的细胞密度适宜,5天到一 周即可形成单层。

3.一般情况,传代后的细胞在2小时左 右就能附着在培养瓶壁上,2~4天就可 在瓶内形成单层,需要再次进行传代。

四、注意事项

1.取材要求新鲜,无菌,解剖小鼠时,注意不 要损伤脾脏及其周围的脏器,尤其是肠道等,防止污染脾脏。

2.冲洗脾 脏时要尽量洗净血污,去除无用组织,并要防止组织干燥。

3.碾磨后 及时用清水冲洗筛网,防止组织、细胞阻塞网孔。

4.计数前,注意吸 尽平皿里的细胞,充分混匀,使细胞 分散成单个细胞。

5.实验操 作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边 缘非无菌区域操作。

6.金属器 械不能在火焰中烧的时间过长,烧过的 金属镊要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤。

7.另外胶 塞过火焰时也不能时间长,以免烧 焦产生有毒气体,危害培养细胞。

8.吸取过 营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留 在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时 会把有害物带入营养液中。

9.不能用 手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部,吸管前 部等所有可能与细胞接触的部分,如已接触,要用火 焰烧灼消毒或取备品更换。

10.开启、关闭长 有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短。防止因 温度过高烧死细胞。

11.换液时倾倒废液,瓶口不能接触废液缸,速度不能过快,防止废液四溅。

12.吹打细胞时,要注意 边角的细胞是否吹打下来。

13.手或相 对较脏的物品不能经过开放的瓶口上,即不可 以在开放容器上方操作。

14.每次操 作只处理一株细胞,以免造 成细胞交叉污染。

15.注意自身的安全,对于来 自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中,应避免 引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂例如DMSO,并避免 尖锐物品伤人等。

16.从增殖 期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但zui好为对数生长期细胞。在冻存前一天zui好换一次培养液。

17.将冻存 管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤。

18.冻存和复苏zui好用新配制的培养液。