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多克隆 抗体的免疫电泳操作流程

时间:2016-08-03 浏览次数:1147

实验原理

 

免疫电泳又称为γ球蛋白 电泳或免疫球蛋白电泳技术,这是一 种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的实验方法。在这项实验技术中,首先利 用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离,然后将 特异性的抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中,在抗原 和抗体的扩散过程中,抗原和 抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生。0.85%盐不仅 可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白,抗原和 抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。

免疫电 泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定,也可用于其它方面,比如免 疫复合物的筛选、各种异 常丙种球蛋白血症的识别和鉴定等。免疫电 泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠,的实验方法,可观察 蛋白质结构的变化和浓度的改变。

 

实验试剂

 

1. 水平电泳仪

2. 打孔器

3. 滴管

4. 刀片

5. 电源

6. 水浴(55℃)

7. 烧杯(400-600ml)

8. 加样枪(5-100μl)

 

实验设备

1. 纯化的抗体;蛋白质混合物;1%琼脂。 
2. Tris-巴比妥缓冲溶液:2.24g 巴比妥酸,4.43g Tris,0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。 
3. 电泳缓冲溶液:将Tris-巴比妥 缓冲溶液与蒸馏水按1:4的比例混合。

实验步骤

 

1. 准备琼脂糖凝胶

将琼脂 和电泳缓冲溶液混合放入90℃水浴加热至溶化,制成1%琼脂,将琼脂 在冷却前铺在水平玻璃板上,待冷却至室温后,按图用内径4毫米的 打孔器打孔及制作凹槽。

2. 电泳

将用电 泳缓冲溶液稀释的4%-5%的抗原 用滴管小心放入小孔中,将胶板 放入电泳槽中并用润湿的滤纸将胶板和电泳槽中的缓冲溶液相连。盖上电泳槽盖,接通电源,6V/cm通电至前沿移动约35mm,时间约为1小时,利用示 踪染料判断移动距离。

3. 扩散

将胶板 移出电泳槽并放在水平位置上,用滤纸 润干胶板凹槽中的缓冲溶液,在凹槽 中加入适量的抗体(0.2ml~0.25ml),注意抗 体不能溢出凹槽以避免污染.将胶板 移至含有叠氮化钠且有一定湿度的盒内,加盖密封后在30℃水浴扩散至少10小时后,移至0.85%盐水中 以终止扩散并洗去未结合的蛋白。

4. 观察抗 原和抗体之间所形成的沉淀线,并进行记录。

 

注意事项

 

1. 免疫电 泳分析法的成功与否,主要取 决于抗血清的质量。抗血清 中必须含有足够的抗体,才能同 被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。

2. 抗血清 虽然含有对所有抗原物质的相应抗体,但抗体效价有高有低,因此要 适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。

3. 免疫电 泳要求分析的物质一方为抗原,另一方 为沉淀反应性抗体。因此没 有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体,均不能 用免疫电泳进行分析。