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核酸探针标记

时间:2015-09-10 浏览次数:1764

实验原理


分子生物研究中,zui常用的探针即为双链DNA探针,它广泛 应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的 合成方法主要有下列两种:切口平 移法和随机引物合成法。
切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的 一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将 核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在 切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射 性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射 性同位素掺入到合成新链中。zui合适的 切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平 移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活 性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶Ⅰ的质量 会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中 的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使 用仔细纯化后的DNA。


锚点

实验试剂


(1) 10×切口平移缓冲液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2);  0.1M/L MgSO4; 10mM/L DTT;  100ug/ml BSA。

(2) 未标记的dNTP原液:除同位 素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mM/L。

(3) [α-32P] dCTP或[α-32P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ:(4单位/ul):溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油,50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5) DNA酶:1mg/ml。

(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

       (7) 10M/L NH4Ac。


锚点

实验步骤


(1) 按下列配比混合:

    未标记的dNTP 10ul

    10×切口平移缓冲液 5ul

    待标记的DNA 1ug

    [α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

    E.coli DNA聚合酶 4单位

    DAN酶 I 1ul

    加水至终体积 50ul

 (2) 置于15℃水浴60分钟。

 (3) 加入5ul EDTA终止反应。

    (4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5M/L, 加入两 倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。


锚点

注意事项


   1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记,但通常使用[α-32 P]-dNTP。

 2、DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到 的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。