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公司新闻

多克隆 抗体的制备步骤

时间:2015-09-10 浏览次数:1888

实验试剂


生理盐水(或PBS)

弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)

弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA)

二甲苯,酒精棉,脱脂棉,2% NaN3


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实验设备


剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把,手术刀架,手术刀片,注射器(1ml、10ml,25ml)附针头,兔子固定架,灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把,直头止血钳两把,手术缝合线,塑料放血管,纱布等。


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实验材料


1. 免疫原:蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

2. 兔子的选择,兔子的 重量应在四斤以上,两耳光滑,明显可见耳静、动脉,健康。


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实验步骤


1. 免疫

用生理 盐水稀释免疫原,然后与 相应的佐剂进行1:1混合。抗原和 佐剂完全混合形成稳定的乳剂,将该乳 剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免 疫原可以持久存在从而提高免疫应答。

注:

抗原注 射以前需要收集一些正常血清,已备检 测抗体时作为阴性对照。待兔子 在新环境中稳定,大概需 要四天左右时间,可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。

免疫用 的抗原必须纯化,否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原 液与佐剂等比例混合后,置于混 合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化,乳化过程比较费时、费力,但若乳化不充分,会影响免疫的效果,振荡后,1000rpm离心一分钟,如水相 和油相不分层即可注射。免疫用FCA,以后都用FIA。

免疫方 法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射,每点注0.1ml,间隔2周后再 于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点,否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次 数在四五次即可,抗原用 量大可以减少次数。

2. 取血

免疫一周后,可以耳 动脉取血检测抗体效价。因为起 初几次免疫产生的抗体的效价比较低,头两次取血,够检测用即可。在三次免疫后,可以获得较价的抗体,每次取血量可以在40ml,不要取太多,否则会造成兔子贫血。

前几次取血用19号针头 对兔子进行耳动脉取血,室温过析出血清。

zui后一次 取血可以采用颈动脉放血,具体操作如下:

   1) 家兔仰 卧于兔架上固定头部,用纱布固定四肢。头部略 放低以暴露颈部。剃毛并消毒皮肤。

   2) 沿颈部 中线用手术刀切开皮肤约10cm,分离皮下结缔组织,直至暴 露出气管两侧的胸锁乳突肌(小心操作,如碰到小血管出血,可用止血钳止血)。

   3) 用直头 止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织,暴露出 颈总动脉后用弯头眼科镊使之游离,剥离神经和结缔组织。

   4) 于动脉 下套入两根黑丝线,分别置 于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端 的动脉用血管夹夹住。

   5) 用小拇指垫在血管下,用尖头 眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口(勿剪断),插入塑料放血管。再将近 心端的丝线结扎固定于放血管上,以防放血管滑脱。

   6) 松开止血钳,使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

3. 血清的分离

如果用 三角瓶或平皿盛血,将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr,转移到4oC沉淀过,第二天 早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集,37oC烘箱放置2hr,转移到4oC沉淀过,第二天早上离心,10000RCF,10分钟。在血清中加入NaN3至终浓度0.02%,分装后-20oC保存。